植物体内的碳素营养状况以及农产品的品质性状，常以糖含量作为重要指标。植物为了适应逆境条件，如干旱、低湿，也会主动积累一些可溶性糖、降低渗透势和冰点，以适应外界环境条件的变化。本实验学习几种定量测定植物体内糖含量的方法。
1.慈酮比色法测定可溶性糖
一、原理
(资料图片)
糖（sugar）在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糖醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。
糖类与蒽酮反应生成的有色物质，在可见光区的吸收峰为630 nm，可在此波长下进行比色。
该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖，而且可以测寡糖类和多糖类，其中包括蔗糖、淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料
新鲜或烘干的植物叶片。
（二）仪器设备
分光光度计，水浴锅，刻度试管，刻度吸管。
（三）试剂
（1）慈酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50mL乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。
（2）浓硫酸（比重1.84）。
三、实验步骤
（一）标准曲线的制作
1.1%蔗糖标准液
将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000 g。加少量水溶解，转入100 mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。
2.100μg/L蔗糖标准液
精确吸收1%蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水至刻度。取20mL刻度试管11支，从0~10分别编号，按表2-32-1加入溶液和水。
然后按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630 nm波长下测其吸光度，以吸光度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。
（二）可溶性糖的提取
取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10~0.30g，共3份，或干材料。分别放入3支刻度试管中，加入5～10mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，反复漂洗试管及残渣，定容至刻度。
（三）显色测定
吸取样品提取液0.5mL于20mL刻度试管中（重复三次），加蒸馏水1.5mL，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的吸光度，计算可溶性糖的含量。
四、结果计算
11. 3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖
12.
一、原理
3，5-二硝基水杨酸溶液与还原糖（各种单糖和麦芽糖）溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和棕红色物的颜色深浅的程度成一定比例关系。在540 nm波长下测定棕红色物质的吸光度，查标准曲线，便可求出样品中还原糖的含量。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料食用面粉。
（二）仪器设备
离心机，电子天平，分光光度计，刻度试管，大离心管或玻璃漏斗，烧杯，三角瓶，容量瓶，刻度吸管，沸水浴。
（三）试剂
（1）1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。
（2）3，5-二硝基水杨酸试剂：6.3g3，5-二硝基水杨酸和262mL2mol/L NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸佩水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。
三、实验步骤
1.制作葡萄糖标准曲线
取7支具有25mL刻度的血糖管或刻度试管，编号，按表2-32-2所示的量，精确加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液和3，5-二硝基水杨酸试剂。
将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25mL刻度处，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀（如用大试管，则向每管加入21.5mL蒸馏水，混匀）。在540nm波长下，用0号管调零，分别读取1~6号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程。
2.样品中还原糖的测定
（1）样品中还原糖的提取：准确称取3g食用面粉，放在100mL的烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加50mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。离心或过滤，用20mL蒸馏水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的上清液或滤液全部收集在100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。
（2）显色和比色：取3支25mL刻度试管，编号，分别加入还原糖待测液2mL，3，5-二硝基水杨酸试剂1.5mL，其余操作均与制作标准曲线相同，测定各管的吸光度。
四、结果计算
分别在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数，按下式计算还原糖的百分含量：
Ⅲ.苯酚法测定可溶性糖
一、原理
植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛（分子式见蒽酮法）能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10~100mg范围内其颜色深浅与精的含量成正比，且在485mm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定吸光度。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，试剂便宜、灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色可稳定160min以上。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料新鲜的植物叶片。
（二）仪器设备
分光光度计，水浴锅，刻度试管，刻度吸管。
（三）试剂
（1）90%苯酚溶液。称取90g苯酚（AR），加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。
（2）9%苯酚溶液。取3mL90%苯酚溶液，加蒸馏水至30mL，现配现用。
（3）浓硫酸（比重1.84）。
（4）1%蔗糖标准液。将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g，加少量水溶解，转入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。
（5）100 μg/L 蔗糖标准液。精确吸取1%蔗糖标准液1mL加入100ml.容量瓶中，加水至刻度。
三、实验步骤
1.标准曲线的制作
取20mL刻度试管11支，从0~10分别编号，按表2-32-3加入溶液和水。
然后按顺序向试管内加入1mL9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以5~20 s加入5mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8mL，在室混下放置30min，比色。然后以空白为参比，在 485 nm波长下比色测定吸光度，以糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准曲线方程。
2.可溶性糖的提取
取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10~0.30g，共3份（或干材料），分别放入3支刻度试管中，加入5～10mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，反复漂洗试管及残渣，定容至刻度。3.测定
吸取0.5ml样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，步骤与制作标准曲线相同，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定吸光度。由标准曲线查出糖的含量。
四、结果计算
IV.斐林试剂比色法测定还原糖
一、原理
植物组织中的可溶性糖可分为还原糖（主要是葡萄糖和果糖）和非还原糖（主要是蔗糖）两类。还原糖具有醛基和酮基，在碱性溶液中煮沸，能把斐林试剂中的Cu2+还原成Cu+，使蓝色的斐林试剂脱色，脱色的程度与溶液中含糖量成正比，在590 nm波长下比色测定吸光度，查标准曲线，即可计算出所测样品中还原糖的含量。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料
新鲜植物样品或烘干粉碎过的植物样品。
（二）仪器设备
分光光度计，分析天平（感量1/10 000），离心机，水浴锅，具塞刻度试管，刻度吸管，容量瓶、研钵。
（三）试剂
（1）斐林试剂A液：40g CuSO4·5H20溶解于蒸馏水定容至1L。
（2）斐林试剂B液：200g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·5H20）与150g NaOH溶于蒸馏水中，并定容至1L。
A、B两液分别贮存，使用前等体积混合。
（3）0.1%葡萄糖标准液：取80℃下烘至恒重的葡萄糖0.1000g，加蒸馏水溶解，定容至100ml。
（4）0.1N NaOH。
（5）甲基红指示剂：0.1g甲基红溶于250ml.60%乙醇中。
（6）(6)10% Pb(Ac)2。
（7）饱和Na2SO4。
三、实验步骤
1.标准曲线的制作
取7支试管，按表2-32-4分别加入各溶液。
将以上各管混合后加塞，于沸水浴中加热15min。取出后自来水冷却，1500 r/min离心15 min。取上清液，用分光光度计在590 nm波长下比色，以蒸馏水作对照，读取吸光度。用空白管的吸光度与不同浓度糖的各管的吸光度之差为横坐标，对应的糖含量为纵坐标，绘制标准曲线。
2.样品中还原糖的提取
取新鲜的植物样品洗净、擦干、剪碎，称取10.00g，放入研钵中研磨至糊状，用水洗人250ml容量瓶中。当体积近150ml左右时，加2~3滴甲基红指示剂，如呈红色，可用0.1 mol/L的NaOH中和至微黄色。若用风干样品，可称取干粉3.00g，先在烧杯中用少量水湿润，然后用水洗入250mL容量瓶中，如显酸性，可用上法中和。
将容量瓶置于80℃的恒温水浴中保温30min，其间摇动数次，以便将还原糖充分提取出来。对含蛋白质较多的样品，此间可加10% Pb（Ac）2，除去蛋白质，至不再产生白色絮状沉淀时，加饱和Na2SO4，除去多余的铅离子。30 min后取出冷却，定容至刻度，摇匀后过滤待测。
3.样品测定
吸取6mL待测液，加4mL斐林试剂，其他操作与标准曲线相同，在590 nm 波长下读取吸光度。以不含样品的空白管的吸光度减去样品管的吸光度，在标准曲线上查出糖含量。
四、结果计算
按下式计算还原糖的百分含量。
